Helios 基因枪操作快速指南
信息来源:   时间:2015-07-17   点击次数:

Helios
基因枪操作快速指南
射击前的准备
1、实验前一天准备好DNA包被的金属微粒载体,加入包被管中做成子弹
2、检查氦气压力(一般比设定的压力高50psi)
3、清洁或灭菌基因枪,子弹储存瓶和枪头衬套
4、连接基因枪和氦气源
5、激活基因枪:放入一个空的子弹夹,按设定压力打开氦气流,按住安全锁并扣动扳机进行2—3次预射击实验
射击
1、将子弹上入弹夹,放入基因枪中相应的位置
2、准备好细胞样品
3、按住安全锁扣动扳机射击
射击后
1、从基因枪中拿下子弹夹
2、从子弹夹中取出子弹
3、关闭氦气
4、旋转缓压表阀使系统减压
5、断开基因枪和氦气的连接
做子弹
1、首先确定金属微粒的量(MLQ)以及DNA的上样量比例(DLR),一般DLR范围是1~5ug/mg金粉,MLQ范围一般是0.25~0.5mg/子弹。(可参照操作说明p19页表格)
2、将DNA包被到金属微粒上。
1)准备好浓度为20mg/ml,溶解在乙醇中的PVP储存液,使用时用乙醇稀释到所需浓度,每30英寸管子准备3.5ml稀释液
2)在1.5ml离心管中称入适量金粉
3)在金粉中加入100ul 0.05M的亚精氨,votex混匀,在超声仪中超声3~5秒打碎金块
4)根据DNA的上样比例在金粉和亚精氨的混合物中加入适量体积的质粒,如果做共转染实验则在这一步分别加入每一种质粒
5)votex 5秒混匀DNA、亚精氨和金粉
6)在可调速度的混匀器上调至中等速度,滴入与第三步中亚精氨体积相等的1M CaCl2,室温下沉淀10分钟
7)在离心机上离心15秒,去除上清液
8)votex使金粉沉淀重悬在剩余的液体中,用100%乙醇清洗三次,每次1ml,离心约5秒
9)最后一次洗涤后将离心沉淀重悬于200ul适当浓度的PVP
乙醇溶液。转吸入15ml离心管,再用200ul PVP乙醇溶液冲洗一次1.5ml离心管并把液体吸入15ml离心管,继续加入PVP
乙醇溶液直到达到所需的MLQ量
3、使用Tubing Prep Station将包被好的金粉加入管道中
1)将Tubing Prep Station连接到氮气源上
2)准备好蠕动泵可用于以0.5–1.0"/sec(0.06–0.12 m
l/sec)的速度抽出管道中的乙醇,也可用注射器手动抽取代替蠕动泵。在注射器头部接入一段(16~18")硅胶管,用金属管套将注射器固定在Tubing Prep Station上
3)剪下一段(约30",75cm)用于做子弹的管子(注意加入
DNA金粉悬浮液前,管道内应保持清洁干燥),从Tubing Prep Station远离氮气接头的一端孔洞中插入一直到达O型密封圈,再往里插入约1cm
4)打开氮气,调节减压阀使减压表上读数处于1~2psi
(1psi=0.006895Mpa),调节流量计的旋钮到刻度0.3~0.4LPM
处,通气干燥至少15分钟,取出管子,调节流量计旋钮关闭氮气
5)将管子的一端插入连接了注射器的硅胶管的一端,votex
混匀金粉悬液(可用超声打碎凝结在一起的金粉块),将离心管颠倒几次重悬。快速打开管盖,迅速将金粉悬液吸入管中(约吸入58cm长),注意不要吸入气泡,吸取时不要votex
。使金粉悬液处于管子中部,两端各留出一段距离
6)立即将管子放于水平位置,插入Tubing Prep Station中,静置3~5分钟,以0.5–1.0"/sec(0.06–0.12 ml/sec
)的速度抽出乙醇,取下连接注射器的硅胶管,立即将管子旋转180°,静置3~4秒
7)将Tubing Prep Station的开关置于ON(I)的位置,开始旋转
8)旋转20~30秒后,打开流量计阀使气流读数在0.35~0.4 LPM处,一边转动一边吹干
9)关闭Tubing Prep Station开关到OFF(O)的位置,关闭流量计阀门,取出管子
4、用切管器将管子切成0.5’’长的子弹
1)检查管子确定金粉均匀涂布在管道内,用剪刀剪去没有涂布到金粉或有金粉凝结成块的区段。
2)用切管器切子弹
a. 将放入干燥剂的子弹储存瓶放入切管器中
b. 将管子插入切管器前面的孔中(可同时放入两根管子),往里推直到轻轻碰触到挡板
c. 用手按下刀片柄,切下的管子会掉入储存瓶中
 3)盖紧瓶盖,做好标记,封上石蜡膜保存于4°C