Profinity eXact预装1ml Bio-Scale Mini 层析柱通常在3ml/min（720cm/hr）速度下使用，但有时速度可达到4ml/min（1,000cm/hr）。5ml的层析柱可以在10ml/min（480cm/hr）速度下使用。这种流速下的背压不超过10psi。为避免纯化过程中压力过高，如果在裂解液或冲洗缓冲液中含有大于20%的甘油或其它的粘性试剂，线形流速不能大于480cm/hr（对于5ml的层析柱来说，速度不大于240cm/hr）。

一倍柱体积（CV）相当于一体积树脂（1CV=1ml，1ml层析柱）。
在样品上柱前留出少量的裂解液。在后面的分析中（如：SDS-PAGE），这部分样品将作为对照泳道上样。
注意：下面的流速是针对1ml层析柱的，5ml层析柱的流速会在括号中注出。

缓冲液的准备
1．冲洗缓冲液（0.1M磷酸钠，pH7.2）。
要避免缓冲液中含NaCl。配好的缓冲液放置于4℃保存。
2．洗脱缓冲液（0.1M磷酸钠，0.1M氟化钠，pH7.2）。
3．清洗缓冲液（0.1M磷酸）。
4．保存缓冲液（0.02%叠氮化钠，0.1M磷酸钠，pH7.2）。

上样和冲洗
5．用10倍柱体积冲洗缓冲液，3ml/min（10ml/min）速度下平衡柱子。
    因为保存缓冲液中含有0.02%的叠氮化钠用来抑菌，为了去除叠氮化物对离子的激发作用，这步预平衡是必须的。
6．在1ml/min（5ml/min）速度下，裂解液上柱。
对于1ml柱子来说，通常上5ml裂解液。
7．用10倍柱体积冲洗缓冲液在3ml/min（10ml/min）速度下冲洗柱子，或直到紫外检测曲线达到基线。

与裂解液的上样相比，在较高的流速下使冲洗缓冲液过柱将缩短纯化的时间。这步可以根据纯化蛋白的需要增加额外的冲洗步骤。

 

洗脱
8．用2倍柱体积洗脱缓冲液在3ml/min（10ml/min）下平衡柱子，或直到柱子流出液的电导率显示柱子已被洗脱缓冲液饱和，则停止洗脱缓冲液的过柱。
9．在室温下，使柱子在洗脱缓冲液下孵育至少30分钟。
如果在4℃进行酶切，则至少孵育12小时。
10. 在3ml/min（10ml/min）速度下，重新开始洗脱缓冲液的上柱，并收集流出液。
    可使用OD280监测洗脱液，以便确定何时停止洗脱缓冲液的上柱。
另一种方法是，在0.1ml/min（0.5ml/min）速度下持续洗脱缓冲液的上柱，在5倍柱体积洗脱液上柱后停止洗脱。

清洗
11.在3ml/min（10ml/min）速度下，至少用5倍柱体积平衡缓冲液冲洗柱子。
12.在3ml/min（10ml/min）速度下，用3倍柱体积清洗缓冲液清洗柱子。
13.用5倍柱体积冲洗缓冲液在3ml/min（10ml/min）速度下平衡柱子。
14.用至少2柱体积保存缓冲液保存柱子，盖好柱子，放于4℃保存。