Experion简明教程
信息来源:   时间:2015-07-13   点击次数:

一、仪器名称:Experion全自动电泳系统

二、规格型号:无


三、生产厂家:美国Bio-Rad公司

四、产品简介
Lab-on-Chip 微流技术为不断发展中的基因组和蛋白质组分析提供了新的机会。Experion全自动电泳系统就是利用Lab-on-Chip 微流技术使得蛋白质和RNA的分析全部自动化。这套微流系统在一个平台上集成了分离、染色和结果分析三大步骤。
Experion系统的核心是一个微流芯片,它由一个小玻璃板和一系列附在上面的塑料小孔组成。玻璃板上刻有许多的微通道,以优化过的网络模式排列。一旦这些微通道内灌入了凝胶和样品,仪器对整个通道网络上的电压和电流进行控制,引导样本通过这些微通道。这种微流芯片和Experion试剂、电泳工作站以及配套软件共同工作,可在不需用户任何干涉的情况下,完成包括电泳,染色,脱色,检测及基础数据分析等几项连续的步骤。
Experion全自动电泳技术可可快速检测蛋白浓度、纯度和分子量; RNA样品的质量和纯度等。由于它对样品消耗极少、操作简便迅速,可广泛应用于蛋白分离纯化、三维结构分析、以及DNA、RNA质量和浓度的检测。
主要技术指标  

    Pro260芯片  RNA标准芯片  RNA高灵敏度芯片
 样品数量  1-10  1-12  1-11
 样品体积  4μl
 1μl  1μl
 动态范围  2.5-2,000ng/μl   5-500ng/μl   100-5,000pg/μl
 分离范围   10-260kD  100-6,000bp   100-6,000bp
 灵敏度   2.5ng/μl的碳酸酐酶    5ng
 100pg

五、技术原理
1. 微流芯片电泳技术:加样孔底部玻璃板内部蚀刻出许多直径不足100m的孔道,并排列成网状,内部充满了液态凝胶。蛋白、核酸等样品就在电压的驱动下,在这些微孔道中电泳分离。
2. 样品荧光染料预标记和激光检测技术:样品分子被特殊的缓冲液中的荧光分子包被,在特定波长的激光激发下产生荧光,并且荧光强度随样品浓度的增加而增加。通过荧光检测就可以知道样品分子的浓度。

六、结构组成



电泳工作站:提供芯片电泳平台,并检测样品荧光强度,把结果输入电脑; 


置胶工作站:将液态凝胶压入芯片底部的微孔道;

涡旋工作站:将样品孔中的不同液体混匀;

配套试剂盒:提供液态凝胶、样品缓冲液、分子量标准品、以及微流芯片;微流芯片包括3种,即Pro260蛋白芯片,标准灵敏度RNA芯片和高灵敏度RNA芯片。

分析软件:控制电泳运行,处理并输出结果。

七、仪器操作规程
蛋白检测方法:
所需设备和试剂:
Experion全自动电泳工作站
置胶工作站
移液器,0.5ml 离心管
离心机
95℃—100℃水浴锅
经过0.2ul膜过滤的去离子水
-ME(catalog# 161-0710)

实验程序简介:

一.Gel-stain溶液和样品Buffer的准备
1将20ul Pro260 stain(蓝色帽)和520ul gel(绿色帽)混合后,加入过滤离心管(spin filter)中,10000g 5分钟离心过滤,制成gel-stain。
2将另外1管520ul gel(绿色帽)加入过滤离心管(spin filter)中10000g 5分钟离心过滤。
注意:使用后余下的gel-stain和gel,须4℃避光保存,有效期为1个月。
3当待检样品要在还原状态下检测,每块芯片的样品容液为:1ul BME(ß-mercaptoethanol)+30ul样品buffer(黄色帽);
当待检样品要在非还原状态下检测,每块芯片的样品容液为:1ul 去离子水+30ul样品buffer(黄色帽)

二.样品和LADDER的准备
1将蛋白样品4ul和2ul样品buffer混合。
2将LADDER 4ul(红色帽)和2样品buffer混合。
3将“1”和“2”2管在95℃加热3-5分钟变性,并离心。
4在上述2管,蛋白样品管和LADDER管中各加84ul去离子水,制备好样品和LADDER。

三.芯片置胶
1从包装中取出一块Pro 260芯片
2在“GS”孔中加入12ul 过滤好的gel-stain溶液
3将加好gel-stain溶液的芯片(步骤2)插入置胶工作站的芯片平台。
4设置置胶程序:压力B,时间3,而后启动。
5置胶完毕后,检查置胶是否完成,芯片的微管道内有否混有气泡。

四.样品和LADDER加样
1吸出置胶后Pro 260芯片GS孔中多余的gel-stain。
2重新在4孔标有“GS”的孔中加入12ul gel-stain;在标有“G”的孔中加入过滤好的胶。
3在样品孔中加入6ul制备好的样品,在L孔中加入6ul制备好的LADDER,如果样品少于10个,须以水或样品Buffer代之。

五.样品电泳检测
启动全自动电泳仪的检测程序。在工具栏中选择并按下键,找到蛋白电泳标识,而后按下旁边的箭头键,即开始检测。
大约30分钟后,检测结束,用户可直接从软件上读出每个条带的分子量、浓度和纯度。

RNA检测方法:
所需设备和试剂:
Experion全自动电泳工作站
置胶工作站(Experion priming station)
旋涡工作站(Experion votex station)
移液器及其配套枪头
无RNA酶(RNase-free)的0.5和1.5 ml 离心管
离心机
DEPC水

实验程序简介:
一.Gel-stain溶液的准备
1在过滤离心管(spin filter tube)加入600lRNA gel(绿色帽)
2 将上述(1)胶1,500g离心10分钟。确保所有胶都通过滤膜后,丢弃滤膜。
注:已过滤的胶可以在4周内使用,4周后如要再使用须重新过滤。
3 在无RNase的离心管中加入65l已经过滤好的胶和1lRNA stain(蓝色帽),振荡混匀,并避光备用。

二.样品和RNA LADDER的准备
1 将RNA Ladder(红色帽)从包装盒中取出,冰上溶化。
2 在无RNase的离心管内加3 l的RNA Ladder。
3 每一个待检样品至少需准备3 l,将样品加入无RNase的离心管内。
4 将样品和RNA Ladder在至少70℃的条件下,2分钟加热变性。
5 2分钟变性后,立刻将RNA Ladder和RNA样品置于冰上,静置5分钟。
6 将上述的变性RNA样品和变性RNA Ladder离心3-5秒钟后,重新置于冰上,待用。

三.芯片置胶
1从包装中取出一块RNA stdsens芯片
2在“GS”孔中加入9ul 制备好的gel-stain溶液
3将加好gel-stain溶液的芯片(步骤2)插入置胶工作站的芯片平台。
4设置置胶程序:压力B,时间1,而后启动。
5置胶完毕后,检查置胶是否完成,芯片的微管道内有否混有气泡。

四.样品和LADDER加样
1在其它标有“GS”的孔中加入9ul gel-stain;在标有“G”的孔中加入9ul过滤好的胶。
2上样缓冲液(Loading buffer黄色帽)在使用前,要充分振荡。
3在每一个样品孔(1~12)和标记有L的ladder孔中,加入5ul上样缓冲液(Loading buffer)
4 加1ul变性的RNA Ladder至标记有L的加样孔中。
5 在每一个样品孔中加1ul待测样品
6如果待测样品少于12个,应在没有样品的加样孔中加1ul上样缓冲液或DEPC水
7 将加好样的芯片置于振荡器(vortex staion)中振荡1分钟。

五.样品电泳检测
启动全自动电泳仪的检测程序。在工具栏中选择并按下键,选取RNA StdSens 的程序:真核细胞全RNA,原核细胞全RNA,mRNA(Eukaryotic totalRNA, Prokaryotic total RNA, mRNA),而后按下旁边的箭头键,即开始检测。
大约30分钟后,检测结束,用户可直接从软件上读出每个条带的分子量、浓度和纯度。

八、注意事项
1所有试剂须4℃储存
2使用前,试剂应在室温平衡15-20分钟。试剂盒中所含的二甲基亚砜(DMSO)应在使用前完全溶解。
3使用前所有试剂必须振荡悬浮。
4避光保存试剂盒中的染料(Stain),样品buffer,gel-stain solution
5实验操作时须一次性手套,操作芯片时仅需接触芯片边缘,切勿接触芯片玻片,在加样和样品制备时,应防止污染
6样品加完后,应在5分钟内进行检测。时间放置过长,会使样品蒸发,导致实验结果错误。
7当电泳检测进行时,切勿打开全自动电泳工作站。
8切勿将全自动电泳工作站放置于不稳的实验台面。
9缓慢将试剂和样品垂直的加入芯片孔中,切勿将移液管中的气泡加入芯片孔中。
10在样品准备和试剂准备时,切勿使用包被和处理过的管子,否则会导致错误结果。
11操作全自动电泳仪前3小时,须将空调打开,温度在15-25℃,空气湿度在60%以下。

九、常见故障维修与保养
- 全自动电泳仪信息显示“Chip error”:
. 芯片中1个或多个加样孔没有正确加样,或者电极没有完全浸入溶液。因此,所有加样孔必须加样,没有加样品的孔须补加空白样品或重复加样。
. 如果1个或多个加样孔中含有气泡,那么就会影响实验结果。补救办法是:轻轻拍击芯片,或者用一干净的枪头去除芯片内的气泡。当使用枪头去除气泡时,须将枪头垂直深入进加样孔底部,缓慢的吸取液体,切勿在最后一步将气泡混入芯片。
-制胶工作站信息显示“Check Seal”:
检查或者更换制胶工作站中的“O”垫圈。
重新确认制胶工作站中是否有RNA芯片,或者RNA芯片是否安置正确。
-全自动电泳图谱中未检测到峰
加样孔中有气泡,或者没有正确地制胶,或者没有正确地加样品。
改进方法是:分别在制胶和加样阶段仔细检查芯片中是否混入气泡。
所加样品量过少。改进方法:
确认所有加样孔中有6l的溶液,并确认每一个未加待检样品的孔中都有上样缓冲液,TE,或者DEPC处理过的水。
电泳管道中有阻塞物。
改进办法:使用高质量的实验用水(如本公司的全自动电泳仪专用DEPC处理水)。或者,重新过滤一下胶溶液。
-全自动电泳图谱中仅观察到很小的峰
加样孔中有气泡。
改进方法:在加样完成后,应将芯片翻转,从背面仔细检查是否混入气泡。
 确认RNA芯片是否正确安置入全自动电泳仪中。
确认移液枪是否校准正确,加样孔内所有溶液体积应≦10ul
-整个芯片检测效果不佳
芯片中混有气泡。
改进方法:在制胶完成后,检查芯片中是否含有气泡。
在制胶时,错将胶加进别的加样孔,而没有加进标有“gel”的孔中。
改进方法:制胶前,须确认gel-stain溶液的加样孔,避免错加。
制胶工作站显示器显示:“Repalce Seal”,但是芯片仍旧处于制胶过程中。
改进方法:检查“O”型垫圈是否放置正确,或者更换“O”型垫圈。
RNA StdSens analysis kit的试剂没有经过室温平衡。
改进方法:RNA StdSens analysis kit使用前,提前将其取出,使其室温平衡,并将各试剂充分振荡。
试剂有可能降解或失效。
改进方法:各试剂在使用前,须确认其是否在保质期内。光敏感试剂,必须避光保存。
电极上有RNase污染。
改进方法:须用全自动电泳仪专培的电极清洗液清洗电极。去处电极上的RNase或其他污染物。
-Ladder的条带和样品的条带分辨不清。
RNA Ladder或样品,或者两者都没有充分变性。
改进办法:将样品和RNA Ladder于70℃加热2分钟,并迅速置于冰上。切勿使用反复加热或冻溶的RNA Ladder,因为这样RNA Ladder会降解。
样品或RNA Ladder峰发生降解。
改进办法:使用无RNase污染的离心管和移液枪头,切勿使用高压灭菌后回收的离心管。

十、思考题
1.全自动电泳可以给出那些样品信息?答:分子量、浓度和纯度
2.全自动电泳结果的重复性、准确性受哪些因素影响?答:试剂的质量、仪器上激光器聚焦的准确度、操作的精确性等。