概述 …………………………………………………………………2
第一节 仪器清点和客户所需的实验准备…………………………2
第二节 Rotofor TM Cell start kit主要组成…………………………2
第三节 实验装置安装和实验操作…………………………………3
第四节 拆卸和清洗…………………………………………………7



Rotofor系统是一种有别与其他电泳的液相等电聚焦。它能根据目标蛋白的等电点的不同，有效地纯化蛋白至500倍以上。具有电泳时间短，样品蛋白便于收集，保持活性蛋白的生物学特怔的优点。

1．1电泳仪主要部件和附件：

1样品收集器，2Rotofor安全盖，3Rotofor电泳仪基座，4冷却陶瓷芯，5阴阳电极，6O型垫圈，7离子交换膜（电极膜），8电极封盖，9密封圈，10聚焦核心膜，11聚焦室，12聚焦室密封圈，13收集管架

1．2主要辅助设备
1 真空泵
2 冷却水循环仪
3 样品收集管
4 外接电源PowerPac HV

5去离子水100ml；20ml，100ml，1000ml移液器，100ml烧杯，移液器枪头

阳极膜（阳离子交换膜）：1个，在33ml 0.1M H3PO4 电解液中平衡
        阴极膜（阴离子交换膜）：1个，在33ml 0.1M NaOH  电解液中平衡
Bio-Lyte pH 3-10 两性电解质，10ml
        标准蛋白质样品，1ml (藻青蛋白2mg蓝色蛋白pI 4.5-5.5,血色素2mg红色蛋白pI 6.0-7.5,细胞色素 C 2mg橙色蛋白pI 8.0-9.0)
         电极封闭盖：2个
样品上样注射器
1．样品准备：
样品必须处于溶液状态，盐离子浓度不能过高（不高于10mM ），两性电解质浓度和样品浓度相关,条件需要摸索。（详见操作说明全文）
原则上，蛋白质上样量与两性电解质浓度关系如下“（Bio-Lyte ampholyte w/v）
蛋白量        Bio-Lyte %
>2mg         2%
1mg          1.5%
0.5mg         1%
0.25mg        0.5%

本实验Start Kit标准实验样品制备：
A. 按以下量配制样品（用于标准形（standard focusing chamber）等电聚焦实验）
58 ml dH2O
1 ml sample
3 ml Bio-Lyte ampholytes (pH range 3/10)
B. 按以下量配制样品（用于小型（mini focusing chamber ）等电聚焦实验）
18.5 ml dH2O
0.5 ml sample
1.0 ml Bio-Lyte ampholytes (pH range 3/10)
2． 平衡离子交换膜：
阴极膜（干时颜色较浅，放在黑色阴极里）用0.1M NaOH 浸泡 ；阳极膜（干时颜色较深，放在红色阳极里）用0.1MH3PO4 浸泡，平衡过夜。膜可反复使用4-5 次，平时可放蒸馏水内保存。注意阴/阳极膜在湿润后颜色都变深，很难再区分安装。
Start kit中的离子交换膜（电极膜）已经平衡了。
3．如图1 对于Standard focusing chamber 把小o-ring 放到inner assembly 的中心,把大O-型环 放到electrode assembly 上。而mini focusing chamber，在out portion上仅有1个大的O-型环这些环起了密封防漏液作用。
4．如图2 在两个inner assembly 的平面上先放一个gray gasket（灰垫），然后放上对应的离子交换膜，再放一个gray gasket。注意在inner assembly 上有两个突出的小针，在离子交换膜和灰垫上都有3 个不对称的小孔，它们起了帮助对齐的作用。将阳极电极膜安装于阳电极，阴极电极膜安装至阴电极。正确的灰垫安装不能将电极上的6个小孔堵住。
5． 把inner assembly 和electrode assembly 对齐合上，拧紧，这样做成了2 个模块，阴极电极模块和阳极电极模块。
6． 如图3 把阴极模块套入ceramic cooling finger（冷却芯），拧紧模块上的螺丝（黑色）
7． 如图4 把membrane core（膜芯，白色）套入冷却芯
8 把focusing chamber(聚焦槽)套入膜芯，拧紧黑色的 nylon retaining screw(固定螺丝)
9把第4 步做好的阳极模块套入冷却芯，和聚焦槽对上，拧紧固定螺丝，如图5，这样完成了整个聚焦装置的装配。
10把装配好的聚焦装置放置到支架上。
11．打开vent button（气孔）图4，在阴极加入0.1M NaOH，在阳极加入0.1MH3PO4 溶液各25-30ml，刚刚没过聚焦槽中心线为好，拧回气孔螺丝。这一步也可在第4 步以后进行加样。在每次样品电泳时，须新鲜配置电极液。
12．接上主机上的电源（支架后部，220V 电源），打开主机，聚焦槽会在支架上慢慢旋转，当收集面（平面，带20 个收集小孔）冲上时停止旋转，用胶带封住收集面，安上密封盖（黑色，带灰色胶垫），拧紧固定螺丝（黑色）
13 重新打开主机，当聚焦槽旋转到加样面（带凹槽，加样小孔）冲上时停止旋转，用一注射器把样品注入聚焦槽腔体，样品会通过一个加样孔弥散到整个腔体，图6。标准型可加40-55ml，迷你型加18-20ml
14．安上密封盖（黑色，带灰色胶垫），拧紧固定螺丝。
15．将冷却芯和一冷却循环泵，一般可在实验前将冷却芯在4 度放置预冷。实验温度一般设定在低于样品所需的温度10 度，将系统温度平衡10-15min
16．合上主机机盖，连接上电泳仪。将主机开关至ON和RUN 一档
17．设定恒功率12W（迷你型），15W（标准型）开始聚焦。聚焦开始的电流/电压值和样品的盐浓度相关，一般需3-5hr 电压会达到稳定聚焦状态（电流/电压变化示意图如下），再运行30min 即可完成聚焦。在聚焦的过程中，聚焦槽会慢慢旋转避免样品沉淀收集
18．在收集器内装好20 支12x75mm 的试管，将收集器和一真空泵连接，打开真空
19．将主机上的开关打到harvest（收集）位置，聚焦槽会慢慢转到收集的位置：收集面冲下
20．关闭电源，打开主机盖，卸下两个密封盖（收集面和加样面各一个）
21．将收集针快速地穿破胶带插入收集面上的收集孔，图7，样品被收集到20 个试管里
实验结果如下图：

1．关闭真空，关闭电源清，用蒸馏水立即清洗针头及相连的管路拆开聚焦模块，把所有的配件用蒸馏水清洗。
2．阴阳极膜可先用0.1M NaOH 浸泡以去除蛋白，然后用蒸馏水充分清洗后在蒸馏水中浸泡下次使用。

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