485梯度生成仪主要用来灌制线性和指数型聚丙烯酰胺凝胶。其容积为175ml，可以同时灌制12块Mini-PROTEAN 3梯度胶，也可用来灌制PROTEAN II胶。

一. 用多板凝胶灌胶器灌制多块梯度胶
注意：此灌胶方法可以用来灌制线性或凸形指数梯度胶。此方法的很少制胶数为4块Mini-PROTEIN 3胶。初学者可提前熟悉所有的操作步骤以便快速完成灌胶。在操作未聚合的丙烯酰胺胶时需要带好橡胶手套。
1. 计算所需丙烯酰胺胶体积
请参照附录计算所需丙烯酰胺胶的体积。梯度生成仪的小工作体积为40ml。
2. 计算混合槽和储存槽中所需胶体积
灌制线性梯度胶时，混合槽和储存槽中各装入1/2总体积的胶。
灌制凸形指数梯度胶时，在混合槽（标有light）中的溶液的体积为总体积的1/4（很小10ml），在储存槽（标有heavy）中的溶液的体积与胶的总体积相同（很小40ml）。
除APS和TEMED 外混合所有的试剂，真空脱气至少15分钟。
3. 安装多胶灌制器
请参照Mini-PROTEAN 3多胶灌制器手册，确保所有配件干净和干燥。
4. 灌胶
注意：如果灌胶速度保持恒定，则所灌制的胶的梯度具有重复性。管子的尺寸，混合槽中的聚丙烯酰胺的体积及搅拌速度需要保持恒定。如果搅拌速度发生改变，则从后面槽进入前面槽中的丙烯酰胺的体积将发生改变，结果会导致胶梯度的变化。
（1）灌制线性梯度胶
a. 准备连接管，使其连接活塞阀和胶灌制器输出端之间距离尽可能短。
注意：梯度生成仪的活塞阀的水平高度一定要高于三明治胶结构的顶部。此操作可产生足够大的静水压，使胶的灌制可在10分钟之内完成（从加入催化剂开始算起）。要产生均一梯度的胶，在丙烯酰胺开始聚合之前，所有的胶溶液都要灌入胶三明治中。
b. 在混合槽中加入1″搅拌子（阀杆呈关闭状态）。把梯度生成仪放置于磁性搅拌器上。
c. 在“light”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入混合槽中。从此步骤开始后面的操作要在10分钟之内完成。
d. 在“heavy”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合液倒入储存槽中。打开搅拌器并调节转速。漩涡的底部应与储存槽中丙烯酰胺高度相同。
e. 快速打开阀杆和活塞。丙烯酰胺将通过管子流入三明治结构中。此过程要避免气泡的产生。用水或水饱和异丁醇覆盖丙烯酰胺。注意：每块胶的覆盖液的体积要相同。如果是灌制连续胶系统，则为每块胶插入一个梳子（以一定角度插入以避免气泡的形成）。
f. 在胶灌好后，关掉多板凝胶灌胶器的活塞。拿掉管子。立即用水冲洗梯度生成仪以防止胶残留在系统中。
（2）灌制凸形指数梯度胶
a. 准备连接管，使其连接活塞阀和胶灌制器输出端之间的距离尽可能短。
注意：梯度生成仪的活塞阀的水平高度一定要高于三明治胶结构的顶部。此操作可产生足够大的静水压，使胶的灌制可在10分钟之内完成（从加入催化剂开始算起）。为产生均一的梯度胶，在丙烯酰胺开始聚合之前，所有的胶溶液都要灌入胶三明治中。
b. 在混合槽（ 标有light）中加入1″搅拌子（阀杆呈关闭状态）。把梯度生成仪放置于磁性搅拌器上。
c. 在“light”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入混合槽中。维持阀杆的关闭状态，后面的操作要自在10分钟之内完成。
d. 立即把指数活塞插入到混合槽中距离丙烯酰胺胶液面1cm处，旋紧顶部螺丝以固定指数活塞。
e. 在“heavy”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把胶溶液倒入储存槽。打开搅拌器并调节转速。漩涡的底部应与储备槽中丙烯酰胺高度相同。
f. 快速打开阀杆和活塞。丙烯酰胺将通过管子流入三明治结构中。此过程要避免气泡的产生。用水或水饱和异丁醇覆盖丙烯酰胺。注意：每块胶的覆盖液的体积要相同。如果是制作连续胶系统，则为每块胶插入一个梳子（以一定角度插入以避免气泡的形成）。
g. 在胶灌好后，关掉多板凝胶灌胶器的活塞。拿掉管子。立即用水冲洗梯度生成仪以防止胶残留在系统中。
二. 灌制单块大型梯度胶
因为梯度形成仪所需的很小体积为40ml，所以我们不推荐用该仪器灌制单块的Mini-PROTEAN 3梯度胶。该仪器可用来灌制大型的丙烯酰胺胶。
初学者可提前熟悉所有的操作步骤以便能快速完成灌胶。在操作未聚合的丙烯酰胺胶时需要带好橡胶手套。
注意：如果灌胶速度保持恒定，则所灌制的胶的梯度具有重复性。管子的尺寸，混合槽中的聚丙烯酰胺的体积及搅拌速度需要保持恒定。如果搅拌速度发生改变，则从后面槽进入前面槽中的丙烯酰胺的体积将发生改变，结果导致胶梯度变化。
1. 计算所需丙烯酰胺胶体积
首次灌制一定厚度的凝胶时，要先确定好凝胶的体积，然后在胶三明治结构中注入相应体积的水，所需准备的的胶体积为该体积再加5ml后的体积。梯度生成仪的很小工作体积为40ml。
2. 计算混合槽与储存槽中胶体积
请参照多板凝胶灌胶器灌制多块梯度胶中混合槽中胶体积的计算方法。
3. 安装玻板三明治
请参照相关制胶器的安装说明来安装玻板三明治。
4. 灌胶
注意：梯度生成仪的活塞阀的水平高度一定要高于三明治胶结构的顶部。此操作可产生足够大的静水压，使胶的灌制可在10分钟之内完成（从加入催化剂开始算起）。为产生均一的梯度胶，在胶开始聚合之前，所有的胶溶液都要灌入三明治中。
（1）从顶部灌制线性或凹型梯度胶
注意：此情况下，“heavy”溶液要倒入标有“light”的混合槽中。“light”溶液要倒入标有“heavy”的混合槽中。
a. 使活塞阀和管子末端的针头之间的管子尽可能短。以一定角度切掉管子的末端。灌胶时，将针头或管子的末端倾斜抵在玻板上进行灌胶。
b. 在混合槽（标有light）中加入1″搅拌子（阀杆呈关闭状态）。
c. 在“light”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入储存槽（标有heavy）中。维持阀杆的关闭状态，后面的操作要自在10分钟之内完成。
d. 在“heavy”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入混合槽（标有light）中。打开搅拌器并调节转速。漩涡的底部应与储备槽中丙烯酰胺高度相同。
如果要灌制凹型梯度胶，则在混合槽中插入指数活塞至丙烯酰胺液面1cm处，旋紧活塞以固定活塞，打开搅拌器。
e. 快速打开阀杆和活塞。丙烯酰胺将通过管子和针头流入三明治结构中。此过程要避免气泡的产生。用水或水饱和异丁醇覆盖丙烯酰胺。如果是制作连续胶系统，则插入梳子（以一定角度插入以避免气泡的形成）。
f. 拿掉管子并拆除梯度生成仪。立即用水冲洗梯度生成仪以防止胶残留在系统中。
（2）从底部灌制线性或凸形梯度胶
进行此种类型胶的灌制时，“light”溶液要倒入混合槽中（标有light），“heavy”溶液要倒入储备槽（标有heavy）中。灌胶过程中，light溶液将从三明治结构的底部进入后升至顶部，heavy溶液将填充胶的底部。
初学者可提前熟悉所有的操作步骤以便能快速完成灌胶。在操作未聚合的丙烯酰胺胶时需要带好橡胶手套。
a. 使活塞阀和管子末端的针头之间的管子尽可能短。把针头插入胶三明治结构底部的垫圈中。
b. 在混合槽（标有light）中加入1″搅拌棒（阀杆呈关闭状态）。
c. 在“light”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入混合槽（标有light）中。维持阀杆的关闭状态，后面的操作要自在10分钟之内完成。
如果要灌制凸型梯度胶，则在混合槽中插入指数活塞至丙烯酰胺液面1cm处，旋紧活塞以固定活塞。
d. 在“heavy”溶液中加入催化剂，振荡8-10次，把混合溶液倒入储备槽（标有heavy）中。打开搅拌器并调节转速。漩涡的底部应与储备槽中丙烯酰胺高度相同。
e. 快速打开阀杆和活塞。丙烯酰胺将通过管子和针头流入三明治结构中。此过程要避免气泡的产生。用水或水饱和异丁醇覆盖丙烯酰胺。如果是制作连续胶系统，则插入梳子（以一定角度插入以避免气泡的形成）。
f. 拿掉管子并拆除梯度生成仪。立即用水冲洗梯度生成仪以防止胶残留在系统中。
三. 梯度生成仪的维护和保养
梯度生成仪在使用后，先拆除仪器并用蒸馏水冲洗所有零件。可拿掉阀杆和活塞进行彻底冲洗。针头可进行替换。生成仪配套的管路连接套装包括聚乙烯管，接头，活塞和Y型连接器。梯度生成仪使用中不能使用有机溶液，强酸或酒精。

附录：12块Mini-PROTEAN 3胶制胶体积估算
胶的厚度                     12快胶的体积                所需准备的胶的体积
0.5mm                        70ml                        75-80ml
0.75mm                       80ml                        85-90ml
1.0mm                        100ml                       105-110ml
1.5mm                        140ml                       145-150ml
以1.0mm 4-20%梯度胶为例说明胶体积的计算过程：
制作12块1.0mm的胶，需要100ml胶，要准备110ml胶溶液。把110ml的胶平均分至两个槽中，即55ml于“light”槽中，55ml于“heavy”槽中。
胶体积的计算：
Light溶液（4%）
丙烯酰胺
30%储备胶
（30%）（Xml）=（4%）（55ml）                 X=7.3ml
Tris-Cl缓冲液
1.5M Tris-Cl储备缓冲液 pH8.8
（1.5M）（Xml）=（0.375M）（55ml）             X=13.8ml
水
（55ml）-（7.3ml+13.8ml）=X                    X=34ml
APS
10%储备液
（500μl）/（100ml）=（X μl）/（55ml）           X=275μl
TEMED
为APS体积的10%；（275μl）/10=X              X=27.5μl
Heavy溶液（20%）
丙烯酰胺
30%储备胶
（30%）（Xml）=（20%）（55ml）                 X=36.7ml
Tris-Cl缓冲液
1.5M Tris-Cl储备缓冲液 pH8.8
（1.5M）（Xml）=（0.375M）（55ml）             X=13.8ml
水
（55ml）-（36.7ml+13.8ml）=X                    X=4.5ml
APS
10%储备液
（500μl）/（100ml）=（X μl）/（55ml）           X=275μl
TEMED
为APS体积的10%；（275μl）/10=X              X=27.5μl