785真空转印仪简易操作指南
信息来源:   时间:2015-07-09   点击次数:

真空泵安装
1.按图连接安装各部件。

2.通过软管连接转印仪底部和一个带支管的三角烧瓶(1500至2000ml容积)。在三角烧瓶上塞紧一个塞子,上面插入一个5ml的吸量管。
3.连接真空管与5ml吸量管;真空管另一端连接真空调节器出口。

真空转印仪的准备
1.剪一块尼龙膜,要求其大小比窗口密封垫的边缘至少宽0.5cm。再剪一张与尼龙膜大小一致的滤纸。
2.剪一块窗口密封垫,要求密封垫的边缘比胶的边缘至少窄0.5cm。如:胶是15×10cm,则密封窗的尺寸为14×9cm。

胶的预处理
1.用等浓度的琼脂糖胶封住胶孔,待胶凝固后进行下面处理。
2.有三种转印过程:标准转印过程;快速转印过程;RNA转印过程。
A.标准转印过程
(1)把胶置于0.25N HCl中15分钟,轻柔振荡。
(2)把胶从HCl中拿出后用去离子水冲洗胶两次。
(3)把胶置于0.5N NaOH中30分钟,轻柔振荡。
(4)在10×SSC中转膜90分钟,压力为5 inches Hg。参见下面的转印的具体过程进行转印。
B.快速转印过程
(1)把胶置于0.25N HCl中15分钟,轻柔振荡。
(2)把胶从HCl中拿出后用去离子水冲洗胶两次。
(3)冲洗后立即把胶置于转印仪中,在0.5N NaOH,0.6N NaCL缓冲液中,压力5 inches Hg条件下转膜90分钟。参见下面的转印的具体过程进行转印。
C.RNA转印过程
(1)在电泳后用去离子水冲洗胶。
(2)在10×SSC中转膜90分钟,压力为5 inches Hg。参见下面的转印的具体过程进行转印。

真空转移
1.把尼龙膜以45度角方向浸入水中,润湿膜,然后在在合适的转印溶液中浸润膜。
2.把孔状真空板置于平台上。依次放置润湿的滤纸,尼龙膜,用10ml的玻璃管赶走膜上的气泡。
3.用水润湿密封O型环。
4.把窗口密封垫置于膜上。确保密封垫覆盖住整个O型环。同时确保密封垫覆盖住滤纸/膜。请参照下图进行组装。
5.把胶轻柔的置于密封垫上,覆盖住窗口。用玻璃管赶走气泡,确保胶的边缘超出密封垫至少5cm。
6.把密封框置于顶部,锁住密封框。
7.旋松(逆时针)真空调节阀几圈以防止强的内部真空。
8.慢慢的旋紧调节阀直到读数为5 inches Hg。如果使用Bio-Rad的真空泵,需要在转印前预热10分钟。如果不预热,真空泵升压会比较慢,约在10分钟后稳定。
9.沿着窗口的边缘用手指轻轻的按住胶。此操作可帮助在胶和密封垫之间形成紧密的真空密封。
10.轻轻的倒入1000至1500ml的转印缓冲液。检查胶是否移位。如果胶漂浮起来了,需要拆掉密封框,排干转膜液,重新按5至10步骤进行操作。
11.把转印仪的盖子盖好。检查缓冲液的水平面,其高度应该高于胶。检查真空压力,调节至5 inches Hg。
12.在设定压力下转膜90分钟。

转印后操作
1.90分钟后,关掉真空装置。
2.打开密封框,把上层缓冲液排出。
3.拿掉转印胶,位于窗口中的胶应该比位于窗口外的胶薄一半。检查胶中剩余的DNA,可以用EB染色来观察。
4.拿掉窗口密封垫和尼龙膜。把膜浸泡在2×SSC中5分钟,然后把膜夹在两层滤纸中在真空干燥箱中80度干燥30分钟。干燥后的膜即可进行杂交。
5.拿掉转印仪上的滤纸并从底盘中倒掉缓冲液,按要求清洗转印仪。