Bio-Plex悬液芯片系统
信息来源:   时间:2015-07-09   点击次数:

一、仪器名称:Bio-Plex悬液芯片系统
二、规格型号:Bio-Plex 200 System
三、生产厂家:Bio-Rad Laboratories, Inc
四、产品简介
人类基因组计划(HGP)的完成和蛋白质组计划(HPP)的启动,获得了数量巨大的基因和蛋白质信息,而要对如此庞大的信息进行全面的处理和研究,必须设计和利用更为高效的硬件和软件技术,建立新型、高效、快速的检测分析方法。生物芯片正是在这种背景下应运而生,其不仅在高通量基因测序、基因表达研究、蛋白质相互作用等方面发挥重要作用,也将在临床诊断中占据重要地位[1]。液相芯片(liquichip)是新一代生物芯片技术,既能为后基因组时代科学研究提供强大的技术支持,又能提供高通量的新一代分子诊断技术平台。
Bio-Plex悬液芯片系统将先进的软件包、系统检验工具、微球耦联试剂和即用型细胞因子与磷酸化蛋白测试试剂整合在一起,使硬件、软件和检测试剂形成一个功能强大的芯片技术平台,大大提高了结果的精确性和可重复性,使用更加简便高效。该系统为蛋白与核酸研究人员提供了灵活的复合测试方案,可在单个样品中同时分析多达100个生物分子。利用100种不同颜色微球(xMAP技术)标记生物分子配体,每个微球可耦联一个对应不同靶分子的特异反应物。反应物可以是酶底物、受体、抗原或者抗体。检测范围0.2-3200pg/ml或1.95-32000 pg/ml, 自动的校正和校验工具可以保证样品间差异、板间差、系统间差异控制在10%以下,30分钟可以完成96个样品的检测并获得多达10,000个分析数据。多重检测获得的数据可以完全揭示生命分子的相互关系及信号传导途径。
[1] Hulse R E, Kunkler PE, Fedynyshyn J P, et al. Optimization of multiplexed bead-based cytokine immunoassays for rat serum and brain tissue. J Neurosci Method, 2004, 136: 87-98.
五、技术原理
    1、芯片原理:Bio-Plex悬液芯片的核心技术是把微小的颗粒亦称微球(bead或microsphere)分别染成不同的荧光色,然后再把针对不同检测物的蛋白质或寡核苷酸探针以共价的方式吸附到不同颜色的微球上。微球直径为5.6um,其制作过程按照严格的搭配比例掺入两种不同的红色分类荧光染料,根据比例不同可以把球型基质分类为100种,每种标上不同的探针分子,从而可以对一个样本中多达100种不同的目的分子进行同步检测。
    在液相蛋白芯片中,先把针对不同检测物的不同颜色微球混合,然后加入被检测物,在悬液中微球与被检测物特异性结合,并加上荧光标记。由于多种颜色微球可以放在同一反应体系中,所以可以同时对一份标本的上百个指标进行检测。在液相基因芯片中,待测核酸可在聚合酶链式(PCR)扩增中直接加入荧光标记,经过与微球反应后可进行检测。
    2、检测原理: 

    如上图所示,微球被鞘流液体传送系统排成单列通过两束激光,一束判定颗粒的颜色(分类激光)从而决定被测物的类型和性质(定性),另一束(报告激光)测定颗粒上的荧光标记强度,从而决定被测物的量(定量)。所得信号经过光电倍增管后经电脑处理,所得数据可以直接用来判断结果。两束激光分别分析微球上的荧光颜色(特异性)和杂交信号(敏感性),而且激光只分析颗粒一定半径的信息,所以检测特异性强,信躁比高,背景低。
六、结构组成
   七、仪器操作规程
    1、MCV板介绍:MCV板是用于维护(maintenance)、校正(calibration)和校验(Validation)的操作板,大小与一般96孔板相同,如下图所示:
               
左上角两小孔用于Calibration(仪器校正),箭头所示的右边部分用于Validation(校验)。仪器的每一步操作在屏幕上都有MCV板的黄色闪烁操作提示,则在进行操作前必须在闪烁部分加入MCV板上提示的试剂。
    2、开机:
注意:在开机前必须确认鞘流液瓶的鞘流液已经充满(液位在上端出口下),废液瓶必须倾空,并确认两个瓶子与仪器连接完好。如果配有HTF的机器,必须检查鞘流液桶的鞘流液是否足够。
    打开仪器电源,点击电脑桌面的Bio-Plex Manager按钮,进入软件界面。
    3、Start up和仪器预热(warm up):点击工具栏上的Start up按钮,在弹出的窗口中按照黄色闪烁提示将相应的试剂加入到MCV板中,如下图所示,点击该窗口下方的Enter/Retract Plate键,弹出微孔板平台,将MCV板平方在平台上,再按Enter按钮,将MCV板推进仪器中,最后按OK按钮确定,开始进行Start Up。

    Start up结束后,点击工具栏上的按钮,将MCV板取出,然后开始进行仪器预热,点击工具栏上的预热按钮,仪器开始自动预热,一般预热30min。

4、校正(Calibrate):预热结束后进行仪器校正,点击工具栏上的校正按钮,屏幕弹出如下窗口:

输入用户名,选择Calibrate kit的批号(Control Number),CAL1和CAL2的批号在Calibrate kit的瓶子上都有显示,点击该窗口上的Add按钮将该数据输入电脑,如果已经输好,只需选择即可。选择CAL2的Control Number时要确定当次检测的灵敏度范围,选择High RP1(高灵敏度,0.2-3200pg)或Low RP1(低灵敏度,1.95-32000pg)的Control Number。
按OK确定,屏幕弹出MCV板提示窗口:

加入黄色闪烁所提示的试剂,然后将MCV板推入仪器,按OK开始进行仪器校正。
注意:Calibrate kit中的试剂CAL1和CAL2在加入前必须从2-8℃恢复到室温,并进行漩涡混合30秒以上才能使用,每孔加入5滴,DI水加入3mL。
    5、创建和运行方法Protocol setting和run protocol:
    点击工具栏的New 按钮,屏幕即打开方法编辑Protocol窗口,如下图所示:





Step 1:输入方法的一般信息
Step 2:选择分析样本:


如上图所示,选择分析物后,按Add All将其移到选择栏中(Selected)。
如果要增加分析物组合,点击Add Panel按钮,弹出窗口:

   

输入该分析物组合名称,点击右边的Add按钮,弹出上面的右边窗口,将新的kit上的微球编码输入Region栏,把该微球对应的检测物名称输入到Name中,如果要继续增加分析物,点击Add continue按钮,如果编辑结束,则点击Add按钮。然后回到Select Analyte界面进行选择。

Step 3:板格式化,必须对板中各空的分析样本进行规定,以便仪器在读板中自动识别。点击Format Plate后,如下图:

左上角为三个按钮分别为:自动全部重复编码,自动横向重复和自动纵向重复,数字框为规定复孔数目。例如,标准品有8个,要做2复孔,则复孔选择2,鼠标点击横向重复编码按钮,然后鼠标在屏幕所示的板上按标准品所加的位置进行拖动,如从A1孔拉到H2孔,即可得到如上图的格式,对待检样本、对照和背景也同样操作,如果不做复孔则复孔栏选1。
Step 4:输入标准品信息:如下图所示,


Step 5:输入对照样本信息(Control information)
     如果当此实验有对照样本,则该步必须进行编辑,如果没有对照样本,则该步骤可跳过,直接编辑Step 6。如下图,选择分析物,输入对照样本的浓度和稀释倍数即可。

Step 6:输入待检样本信息:


方法编辑结束后可点击工具栏上的保存按钮,将方法保存到指定的文件夹中。
Step 7:运行方法:
将板推进仪器中,点击屏幕run Protocol按钮,在该界面中选择每region 100beads和50uL样品大小,然后点击右上角的Start按钮,屏幕则弹出要求是否自动保存结果,可选择该项,在继续弹出的窗口中选择运行结果要保存的文件夹,按OK后,则开始读板,读板过程如下图所示:

6、结果分析:




7、系统管路清洗、关机:
    如果第一块板读完还要读第二块板,则需要先点击工具栏的Wash between plate按钮,按照弹出窗口的提示在MCV板上加入相应的试剂,然后点OK开始清洗。
    如果当天读板结束,要关机,则点击工具栏上的Shut down按钮,仍按照屏幕提示进行操作,Shutdown结束后,激光关闭,先关闭电脑的Bio-Plex Manager程序,然后关闭机器电源。

八、注意事项
1、每次操作:严格进行每次实验的Start Up,Shut Down和板间清洗Wash Between Plates操作,以避免鞘流系统的管路堵塞。
2、经常注意鞘流液瓶和废液瓶的液面,及时添加鞘流液和倒空废液。经常打开仪器的所有门观察是否漏液,如果漏液及时联系Bio-Rad工程师进行维修。
3、如果仪器预热后闲置4小时,则激光自动关闭,这时如果要读板必须重新预热;如果温度改变2度以上必须重新进行Calibration。)
4、读板前的注意事项:
1)检查滤板是否平整。
        2)目测平板待检孔是否充满buffer。
        3)平板在1100转室温摇床30秒。
        4)检查废液瓶是否倒空和鞘流液瓶是否充满。
九、系统维护与保养      
    1、系统校验(Validation): 每月做一次,仪器搬动后也必须进行校验,检查并验证系统的光学系统、鞘流流路系统、报告激光和分类激光系统等。点击工具栏的校验按钮,在弹出的窗口中选择Validation kit的Control Number,和校验类型,一般选择All,点击OK确定,按照弹出的MCV板提示,在MCV板中加入相应的试剂,如下图:

注意:所有Validation kit中的试剂必须从2-8℃恢复到室温,并进行漩涡混合30秒以上才能使用,每孔加入5滴,DI水和70%异丙醇每孔加入3mL。
    将MCV板推入仪器,开始进行Validation。
查看Validation结果:点击菜单栏的View菜单,选择Validation Results,在弹出的窗口中查看结果。    
2、每月保养:清洁仪器外表,先用温和洗涤剂,后用10%漂白液擦拭仪器外表;若机器长期不用,必须将机器的管路充满20%乙醇,可用20%乙醇代替鞘流液,然后进行Wash Between Plate操作。
十、附件
    附件一:Bio-Plex细胞因子检测操作指南
    附件二:Bio-Plex氨基耦联原理与操作指南

附件一:
Bio-Plex细胞因子检测操作指南

一、检测所需的Kits和设备
   

二、实验准备

1、样品与标准品准备:

1)使用的稀释液如下表:

 样品  样品和标准稀释液
 细胞培养样品  细胞培养液,必须包含培养液所有成分,如FBS等
 灌洗液  灌洗缓冲液,再加入浓度至少为0.5%的BSA封闭
 唾液或其他生物液  以最接近的样品缓冲液溶解,再加入浓度至少为0.5%的BSA封闭
 血清   使用Bio-Plex种属特异稀释液(如上表3)
 血浆  使用Bio-Plex种属特异稀释液(如上表3)

  2)所有样品在使用前必须冰浴冻藏(-20℃或-80℃),血清或血浆以1000g,4℃离心10min,收集上清-20℃保存。
  3)标准品工作曲线准备
    每管冻干标准品加入500uL稀释液(如上表所示),作为标准储存液
    漩涡混合1-3秒,冰浴30min后使用
    根据不同跨度灵敏度范围准备工作曲线样品,准备好小离心管,标号,然后分别按下图进行稀释:

A)1.95-32000pg,以Std1浓度为32000pg/mL:

B)0.2-3200pg,以Std1浓度为3200pg/mL

2、微珠,检测抗体和Streptavidin-PE荧光色素准备:在各自使用前准备,详见工作流程图
  1)微珠:根据检测所用的孔数计算所需微珠体积和稀释液体积,按每孔2uL(25×)微珠,每孔最终加入体积为50uL计算,稀释液为Assay Buffer,一般如下表:
         
     稀释前以中速漩涡混合30秒,冰浴,避光保存直到使用。
       2)检测抗体准备:在转移前30秒快速离心,以Detection Antibody Diluent稀释到1×浓度,注意,不同元检测稀释倍数不同,8因子检测稀释倍数为50,其他具体如下图表:
       
        
      稀释后尽快使用,在室温避光下可稳定保存4小时
      稀释倍数也可以按照如下计算:假如是50×的,每孔需要0.5uL检测抗体,每孔最终加入体积为25uL。

      3)Streptavidin-PE荧光色素准备:在转移前30秒快速离心,稀释液为Assay Buffer,如下表所示:

       
        稀释后尽快使用,在室温避光下可稳定保存4小时,使用时每孔加50uL。
三、实验流程:
    1、校准真空吸板机的真空度,打开吸板机,用96孔板盖住,调节真空阀门到1-2″Hg压力。
    2、倒空废液瓶,将鞘流液装满。
    3、工作流程图:
 
附件二:
Bio-Plex 氨基耦联原理与操作

一、原理
Bio-Plex 氨基耦联试剂盒提供了一些缓冲液,用于将60-150kD分子量的蛋白质共价耦联到5.5um荧光染色的微珠上。耦联反应发生在微珠表面的羧基和蛋白质N末端的氨基上,进行羧胺反应。耦联后形成稳定的共价键,不会轻易脱落,甚至可保存数月。试剂盒可进行30次反应,每次反应需要1.25×106个羧基化的微珠(1倍浓度)。这种蛋白质耦联微珠可用于蛋白质相互作用的研究。一般微珠反应得率为80%,即足够用在Bio-Plex上进行检测的每孔5000个微珠。
    一般耦联需要3步:蛋白质准备,蛋白耦联和蛋白耦联验证。
 A、蛋白质准备:
蛋白质样品的要求:
1、蛋白质分子量:6-150kD,
2、水溶性,
3、样品不得含有如叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它任何含自由氨基的添加物。
4、蛋白质必须溶解在PBS中,pH7.4。
5、必须摸索出最佳的耦联条件,主要是摸索蛋白质的使用量,如下表所示的例子。注意,不需要用最大量的蛋白质进行反应。
             
B、蛋白耦联:耦联反应分2步进行,微珠上的羧基在耦联前需要活化,EDC(1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺)与微珠上的羧基反应形成一种活化的O-酰基异脲(O-acylisourea)中间体,在水溶液中用S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-MAG3)使这种中间体变得稳定。EDC耦联S-NHS产生了S-NHS-活化位点,O-酰基异脲和S-NHS的形成是氨基反应。但是S-NHS酯在生理pH下更稳定,随后这种中间体与蛋白质上的初级氨基反应形成酰胺键。如果这种中间体不能和氨基反应,中间体将脱水并产生羧基,释放出N-未取代脲。这些反应在数分钟内同时迅速反应。
C、蛋白质耦联验证:耦联反应结束后需要对微珠进行计数并验证耦联效率。
用PE(藻红素)标记的抗体连接到耦联的微珠上,再用Bio-Plex进行分析。或者用生物素化的抗体反应再用Streptavidin-PE(链亲和霉素-藻红素),机器读出的荧光信号直接与耦联在微珠表面上的蛋白量相关,如果荧光信号超过2000MFI可认为耦联成功。
二、除耦联试剂盒外所需的仪器和试剂
1、Bio-Plex蛋白质芯片系统
2、Bio-Plex蛋白质芯片系统附件:Validation kit和Calibration kit
3、漩涡混合器
4、离心机
5、组织培养旋转器
6、超声波清洗器
7、细胞计数器
8、蛋白质测定(如lowry法,以BSA作为标准)
9、缓冲液更换层析柱
10、化学试剂:EDC(1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]炭化亚胺),S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) (巯基乙酰基三甘氨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-MAG3)
11、其它试剂:对耦联蛋白特异的抗体(需R-藻红素或生物素标记),
Streptavidin-PE(链亲和霉素-藻红素),
tips头,移液枪,铝箔,小离心管,96孔平底板,小角底槽等
三、耦联操作
A、蛋白质准备:如果样品不含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其它含自由氨基的添加物,并且已溶在PBS,pH7.4中,可测定蛋白质浓度后直接用于耦联;如果样品含有以上任何一种添加物,需要进行如下处理:使用Bio-Spin微型柱进行更换缓冲液,1000g,2min离心去除缓冲液,加入500ul PBS,1000g,2min离心,重复5次,20-75ul的样品上样到柱子中,1000g,5min离心,样品冰浴,测定蛋白质浓度后可直接用于耦联。
注意:更换缓冲液可能导致多达20%的蛋白质损失,
      必须准备足够耦联反应所需的5-12ug的蛋白质
B、耦联反应:在所有试剂使用前必须解冻或回复到室温
    1)微珠活化:
 
2)蛋白耦联:

四、耦联效率验证:可使用2种反应进行验证,一种是用PE耦联的抗体,另一种是先用生物素化的抗体然后用Streptavidin-PE
注意:所用的抗体种属必须一致,例如已经耦联了一个鼠抗人的抗体,那么二抗必须是来源于鼠的抗体,如羊抗鼠和兔抗鼠等。

五、结果分析:
阴性对照(背景)的荧光值不得超过100MFI
       耦联微珠的荧光值超过2000MFI可认为耦联成功,如果耦联不成功,必须分析各种原因,如操作,耦联蛋白质浓度和蛋白量等等。